實時熒光定量pcr儀，由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。

5700將PCR熱循環(huán)，熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況。PCR實驗結(jié)束后可以馬上得到定量結(jié)果，無需凝膠電泳分析，無需純化PCR產(chǎn)物，無需進行任何實驗操作。5700型實時熒光定量PCR系統(tǒng)采用96孔反應(yīng)板或單個及8聯(lián)管，反應(yīng)體積25-100微升，實驗可以在不到2小時內(nèi)結(jié)束。與其他人工基因定量分析方法如Northern blotting or RNase-protection assays相比，5700型實時熒光定量PCR系統(tǒng)具有時間省，靈敏度高，準(zhǔn)確性好和線性范圍寬等優(yōu)點。

1.可進行準(zhǔn)確的定量檢測，實時性和準(zhǔn)確性好。

2.定量范圍寬。

3.靈敏度高。

4.特異性和可靠性更強，克服了假陽性。

5.操作簡單快速，無污染，無須后處理和電泳檢測。

6.安全，技術(shù)易于學(xué)習(xí)，易于進行電腦化數(shù)據(jù)管理.

7.目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量主要用于絕對定量、mRNA基因表達差異，單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因分型檢測，Non-coding RNA和microRNA分析，基因拷貝數(shù)（CNV）分析，DNA稀有突變分析，可檢測占背景野生型細胞0.5%的微量突變細胞或DNA，基于熒光定量PCR儀的蛋白表達和蛋白相互作用分析等。

1、六個檢測通道，可實現(xiàn)5重PCR，可同時檢測5個靶基因，專用FRET檢測通道。

2、有動態(tài)溫度梯度PCR功能，可以同時運行8個不同的溫度，每個溫度孵育時間相同。

3、完全試劑開放，各種科研和臨床試劑適用。

4、適用于多種熒光方法，如Taqman，Molecular Beacon，F(xiàn)RET探針，SYBR Green I等。

5、耗材開放，可使用0.2ml單管、八聯(lián)管、96孔板等。

6、可獨立運行，真正離線操作，無需連接電腦即可實時監(jiān)控PCR熒光擴增曲線。

1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃（左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

2、模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

1.在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA斷裂。

2.為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照。

3.內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4.PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定。

5.防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品，在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

6.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

8.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。