熒光定量PCR檢測(cè)儀，是指通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程的儀器。結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。

熒光定量PCR儀適用于基于能夠在PCR產(chǎn)物生成過程中對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記熒光的反應(yīng)，例如TaqMan、分子信標(biāo)、SYBR Green、MGB等熒光化學(xué)體系。

1、樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。

2、域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。

3、如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。

7500 Fast型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，可在最短的時(shí)間內(nèi)為從事不同應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室提供最佳的實(shí)驗(yàn)性能，同時(shí)還可以進(jìn)行高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）分析。

1.開始運(yùn)行儀器

打開電腦，打開定量PCR儀底座開關(guān)啟動(dòng)CFX Manager軟件。

2.放置樣品

將PCR反應(yīng)體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學(xué)級(jí)封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。

3.設(shè)置程序，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

定量PCR軟件操作基本步驟為：

a.設(shè)置熱循環(huán)程序文件（Protocol Tab），點(diǎn)擊Edit（編輯）或Create New（創(chuàng)建新程序）。

b.設(shè)置反應(yīng)板文件（Plate Tab），選擇本次實(shí)驗(yàn)所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品（Standard），點(diǎn)擊“Dilution Series”鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。。

c.點(diǎn)擊“Start Run”鍵，單擊open lid（打開熱蓋）或Close lid（關(guān)閉熱蓋）放置樣品；單擊Start Run，保存文件，開始運(yùn)行程序。

4.結(jié)果分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值等。如需進(jìn)行表達(dá)量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應(yīng)分析功能。點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報(bào)告單。

5.關(guān)閉運(yùn)行儀器

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出反應(yīng)管，順序關(guān)閉CFX Manager軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦。

1、實(shí)驗(yàn)室注意分區(qū)：試劑準(zhǔn)備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區(qū)分，各房間實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)服不得混用。

2、試劑準(zhǔn)備間及樣本處理間不處理實(shí)驗(yàn)相關(guān)的高濃度的核酸模板（如高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，PCR產(chǎn)物，miRNA的minics等）。

3、減少頻繁多次的走動(dòng)，尤其去過電泳間之后當(dāng)天不可進(jìn)入其他房間。

4、使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置。

5、在檢測(cè)體系中添加UNG酶系統(tǒng)用于避免PCR產(chǎn)物的污染。